Cell Counting Kit-8

细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)增强型

产品编号：AC200-5      规格： 100T/ 500T/ 500T×10

产品内容

产品简介

Cell Counting Kit-8（简称CCK-8） ，是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测的试剂盒。

CCK-8试剂中含有WST-8（化学名 ：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）是一种类似于MTT的化合物 ，它在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（ 1-Methoxy PMS） 存在条件下 ，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物Formazan  （参考图1） ，生成的Formazan数量与活细胞的数量成正比。 因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析 ，细胞增殖越多越快 ，则颜色越深；细胞毒性越大 ，则颜色越浅。

图1. WST-8检测原理图 (EC=electron coupling reagent ，即电子耦合试剂)

WST-8与以往的增殖/毒性测定试剂相比 ，具有明显优点（参考表1） 。 CCK-8试剂盒具有灵敏度高、反应时间短、线性范围宽、数据可靠、重现性好等特点 ，可以广泛应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。

    表 1. 增殖/毒性测定试剂的比较

操作步骤

制作标准曲线（测定细胞具体数量时）

1. 制备细胞悬液 ：细胞计数。

2. 接种到 96 孔板中 ：按比例（例如： 1/2 比例） 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度 ，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度 ，每组 3-6 个重复孔。每孔约 100μl 细胞悬液。

3. 37℃培养箱中培养 ：细胞接种后贴壁大约需要培养 2-4 小时 ，如果不需要贴壁 ，这步可以省去。

4. 每孔加入 10 μl CCK-8 增强型溶液： 由于每孔加入 CCK-8 量比较少 ，有可能因试剂沾在孔壁带来误差 ，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含 10% CCK-8 的培养基 ， 以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡 ， 以免影响吸光度的检测。

5. 培养箱内孵育一定时间后测定 450nm 吸光度 ，制作出一条以细胞数量为横坐标(X 轴) ，吸光度为纵坐标(Y 轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致 ，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8 后的培养时间。）

 细胞活性检测

1. 制备细胞悬液 ：细胞计数。

2. 接种到 96 孔板中 ：根据合适的铺板细胞数 ，每孔约 100μl 细胞悬液 ，可设置 3 个重复孔。

3.  37℃培养箱中培养 ：细胞接种后贴壁大约需要培养 2-4 小时 ，如果不需要贴壁 ，这步可以省去。

4. 每孔加入 10 μl CCK-8 增强型溶液： 由于每孔加入 CCK-8 量比较少 ，有可能因试剂沾在孔壁带来误差 ， 建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀 。 或者直接配置含 10% CCK-8 的培养基 ， 以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡 ， 以免影响吸光度的检测。

5. 培养箱内孵育 0.5-4 小时 ：细胞种类不同 ，形成的 Formazan 的量也不一样 ，对于大多数情况孵育 1 小时即可。如果显色不够的话 ，可以继续培养 ，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan 很少 ，需要较长的显色时间（5-6 小时）。

6. 测定 450nm 吸光度 ：如果暂时不测定吸光度 ，可以向每孔中加入 10 μl CCK-8 反应终止液 ，遮盖培养板避光保存在 2-8℃ ,  在 7 天内吸光度不会发生变化； 或者可以向每孔中加入 10 μl 自己配制的 0. 1M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液 ，并遮盖培养板避光保存在室温条件下 ，在 24 小时内吸光度不会发生变化。

细胞增殖-毒性检测

1. 制备细胞悬液 ：细胞计数。

2. 接种到 96 孔板中 ：根据合适的铺板细胞数 ，每孔约 100μl 细胞悬液 ，可设置 3 个重复孔。

3. 37℃培养箱中培养 ：细胞接种后贴壁大约需要培养 2-4 小时 ，如果不需要贴壁 ，这步可以省去。也可以根据实验要求的不同 ，培养相应的时间。

4. 每孔加入 0-10 μl 不同浓度的待测药物。

5. 37℃培养箱中培养 ：加入待测药物的培养时间 ，要看该物质的性质和细胞的敏感性 ，一般要根据细胞周期来决定 ，起码要一代以上的时间。

6. 每孔加入 10 μl CCK-8 增强型溶液： 由于每孔加入 CCK-8 量比较少 ，有可能因试剂沾在孔壁带来误差 ， 建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀 。 或者直接配置含 10% CCK-8 的培养基 ， 以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡 ， 以免影响吸光度的检测。（注意 ：如果待测物质有氧化性或还原性的话 ，可在加 CCK-8 之前除去培养基 ，并用培养基洗涤细胞两次 ，然后加入新的培养基 ，以去掉药物影响。 当然药物影响比较小的情况下 ，可以不更换培养基 ，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。）
7. 培养箱内培养 0.5-4 小时 ：细胞种类不同 ，形成的 Formazan 的量也不一样 ，对于大多数情况孵育 1 小时即可。如果显色不够的话 ，可以继续培养 ，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan 很少 ，需要较长的显色时间（5-6 小时）。
8. 测定 450nm 吸光度 ：建议采用双波长进行测定 ，检测波长 450-490nm ，参比波长600- 650nm。如果暂时不测定吸光度 ，可以向每孔中加入 10 μl CCK-8 反应终止液 ，遮盖培养板避光保存在2-8℃ ,  在 7 天内吸光度不会发生变化；或者可以向每孔中加入 10 μl 自己配制的 0. 1M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液 ，并遮盖培养板避光保存在室温条件下 ，在 24 小时内吸光度不会发生变化。

      计算公式

细胞存活率 = [(As - Ab)／(Ac - Ab)] × 100%抑制率 = [(Ac - As)／(Ac - Ab)] × 100%

As ：实验孔（含有细胞的培养基、CCK-8、待测药物） 的吸光度

Ac：对照孔（含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测药物） 的吸光度

Ab：空白孔（不含细胞和待测药物的培养基、 CCK-8） 的吸光度

保存条件

4 ℃避光保存 ，一年有效。-20 ℃可以储藏更久 ，但反复冻融会增加背景值 ，干扰实验测定 ， 因此请将经常使用的试剂保存在4 ℃。

注意事项

1. 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。
2. CCK-8 反应时间的确定 ：一般情况下 ， 白细胞显色比较困难 ， 因此需要增加细胞数量和延长 CCK-8 反应时间。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色 ， 因此悬浮细胞在加入 CCK-8 培养 0.5-4 小时后 ，可先从培养箱取出 ， 目测或用酶标仪测定显色程度 ，若显色困难可以继续培养数小时后再确定。对于贴壁细胞 ， CCK-8 的培养时间一般为0.5-4 小时 ，在培养 20 分钟左右即可取出肉眼观察显色程度。
3. 每孔接种细胞数： 当使用标准 96 孔板时 ， 贴壁细胞的最小接种量至少为 1000 个/孔( 100 μl 培养基) 。 检测白细胞时的灵敏度相对较低 ， 因此推荐接种量不低于 2500 个/孔( 100 μl 培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验 ，请先计算每孔相应的接种量 ，并按照每孔培养基总体积的 10%加入 CCK-8 溶液。
4. 设定空白对照 ：在不含细胞的培养基中加入 CCK-8 ，培养一定的时间 ，测定 450 nm 的吸光度即为空白对照。在做加药实验（细胞毒性实验） 时 ，还应考虑药物的吸收 ，可在加入药物的培养基中加入 CCK-8 ，培养一定的时间 ，测定 450 nm 的吸光度作为空白对照。
5. 影响 CCK-8 测定的物质：  由于 CCK-8 检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应 ，所以如果待测体系中存在氧化还原物质则可能会干扰检测结果 ，还原性物质会使吸光度增加 ，氧化性物质会使吸光度减小 ， 因此应需设法去除这些物质的影响。酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响 ，培养基中酚红的吸光度可以在计算时 ，通过扣除只含有培养基的对照孔中本底吸光度而消除 ， 因此不会对检测结果造成影响。
6. 测定波长： 如果样品为高浑浊度的细胞悬液 ， 建议采用双波长进行测定 ， 检测波长450nm ， 参比波长 600-650nm 。 如果没有 450nm 的滤光片 ， 可以使用吸光度在 430- 490nm 之间的滤光片 ，但是 450nm 检测灵敏度最高。
7. 当在培养箱内培养时 ，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发 ， 由于体积不准确而增加误差。一般情况下 ，最外一圈的孔只加培养基 ，不作为测定孔用。
8. 如果细胞培养时间较长 ，培养基颜色发生变化 ，应洗涤细胞更换培养基后再加 CCK-8检测。
9. 为了您的安全和健康 ，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。